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分子生物学在微生物检验中的应用

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分子生物学在微生物检验中的应用 湖南省疾病预防控制中心 微生物检验科 黄一伟 分子诊断学 分子诊断学是以分子生物学理论为基础,利用 分子生物学的技术和方法研究人体内源性或 外源性生物大分子和大分子体系的存在、结 构或表达调控的变化,为疾病的预防、预测、 诊断、治疗和转归提供信息和决策依据。 分子诊断学三个阶段 3个阶段: (1)利用DNA分子杂交技术进行遗传病的基因 诊断; (2)以PCR技术为基础的DNA诊断,特别是定 量PCR和实时PCR的应用,不仅可以检测存在 于宿主的多种DNA和RNA病原体载量,还可检 测多基因遗传病细胞中mRNA的表达量; (3)以生物芯片(biochip)技术为代表的高 通量密集型检测技术,生物芯片技术包括基 因芯片,蛋白质芯片,组织芯片等。 荧光定量 PCR(real-time PCR) ? 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产 物进行标 记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应 的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板 量。 荧光定量 PCR仪 ? 光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测 系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。 荧光定量PCR标记方法 ?内掺式染料 SYBR Green I ?序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) ?引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) SYBR-Green I Excitation SG 5’ 3’ SG SG SG Emission 3’ 5’ SG 荧光共振能量传递(FRET Probe) Oligo 1: Fluorescein Excitation Transfer Oligo 2: LC Red 640 Emission 双标记探针(Taqman Probe) 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ Excitation Excitation R Q Q 3’ 5’ 荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer , FRET) Taqman探针3′端Q荧光分子能够 吸收5′端R荧光分子发出的荧光, 因此,正常情况下该探针检测不 到5′端荧光分子发出的荧光,只能 检测到3′端荧光分子的荧光信号, 但当溶液中有PCR 产物(模板) 时 ,探针与模板退火,即产生了适合 于核酸外切酶活性的底物,从而 激活Taq 酶的5′外切酶活性,将探 针5′端连接的R荧光分子从探针 上切割下来,破坏了两个荧光分 子间的FRET ,从而发出荧光,切 割的R荧光分子数与PCR 产物的 数量成比例,因此,根据PCR 反应 液的荧光强度即可计算出初始模 板的数量 分子信标(Molecular Beacon Probe) R ExcitatEiomnission Q Excitation 引物特异性探针(Amplisenor Probe) 引物特异性探针(Amplifluor Probe) 5’ 5’ 3’ 3’ 55’ ’ 3’ 3’ Excitation Q 3’ Emission 3’ 5’ R 5’ 荧光定量实时PCR与普通PCR的比较 ?实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增 加,直观地看到反应的对数期 ?降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反应的特异 性 ?增加定量的精确性 全程监控,准确的算法进行定量 ?结果分析更加快捷方便,无需跑胶 基因和蛋白质芯片 原理 基因芯片(gene chip)也称为DNA微距阵(DNA microarray)、DNA芯片(DNA chip)等。它是指 将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地高密度地 排列固定于玻片、硅片等固相载体上,然后与 待测的标记样品的基因按碱基互补配对原理进 行杂交,通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯 片进行扫描,再经计算机软件处理,从而获取 大量的信息。 基因微阵列技术优势 基因微阵列技术作为一种高通量的检测 新技术,可以同时检测数以万计的生物分 子,现在已经广泛应用于各个方面,其 中包括病原生物的监控和诊断。 发现未知病原体。例如确定SARS-CoV应 用了基因微阵列技术。 目前国内外蛋白质芯片或基因芯片产品 的进展情况 国外: 赛弗吉生物系统公司(纳斯达克代码:CIPH)的蛋白质芯片系统 已经通过了中国国家食品药品监督管理局(SFDA)的医疗设备审 批。这也是广谱仪器第一次在中国被批准作为一种医疗设备使用。 affymetrix 公司开发出测P53基因是否有突变以判断患癌症可能 性的P53芯片,能诊断药物代谢缺乏症的细胞色素P450芯片. 在 病原体的检测方面, 成功的例子有HBV、丙型肝炎病毒HCV、甲型 肝炎病毒(HAV)、庚型肝炎病毒(HGV)、巨细胞病毒(CMV)、 梅毒、弓形虫、结核杆菌等多种病原体的诊断基因芯片. 另外血 液RD 等25 种红细胞抗体系统以及高血压病因, 血管内皮细胞生 长因子(VEGF)和人促黄体生成激素(hLH)等也都有了诊断基 因芯片。在肿瘤方面,蛋白质芯片已成功地应用于诊*籽  乳腺癌、心力衰竭等疾病的诊断,诊断用的抗体芯片有霍乱毒素、 葡萄球菌内毒素B、蓖麻蛋白和枯草杆菌球体的诊断. 最*, siemens公司、fraunhofer硅工艺研究院和infineon公司正在开 发电化学生物芯片诊断系统. 国内: 上海数康生物科技有限公司研制开发的“多肿瘤标志物 蛋白 质芯片诊断系统”于2001年12月获得国家卫生行政部门颁发 的 新药证书和试生产批文。本实验室采用该诊断系统对12种肿 瘤标志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖原199(CA199)、 糖原242(CA242)、糖原(CA125)



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